Japan.co.jp

毒素タンパク質が細胞を攻撃するとき、もっとも劇的な瞬間の一つは「水に溶けるタンパク質」が「膜を貫く孔」に変わる場面だ。細胞膜は脂質二重層という強固な境界であり、本来は大きなタンパク質を簡単には通さない。ところが一部の細菌毒素は、膜表面に集まった後、自らの形を大きく変えて膜へ刺さり、分子を通すナノサイズの通路を作る。

その転換が、どの順番で起きるのか。京都産業大学生命科学部の山田等仁（やまだ・ともひと）客員研究員、津下英明（つげ・ひであき）教授らと、京都大学医生物学研究所の野田岳志（のだ・たけし）教授、杉田征彦（すぎた・ゆきひこ）准教授らの共同研究が、これまで捉えにくかった「途中」をクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）で連続的に捉えた。研究成果は9月28日、米国科学アカデミー紀要『PNAS』に掲載された。^[1]

対象はウェルシュ菌の「二成分毒素」

研究対象は、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）が産生するイオタ毒素だ。イオタ毒素は「二成分毒素」と呼ばれ、酵素成分Iaと膜結合成分Ibからなる。Ibが標的細胞の膜に結合してリング状に集合し、膜を貫くポアを形成する。その孔を通ってIaが細胞内へ侵入し、アクチンをADPリボシル化することで細胞骨格の機能を乱す。^[2]

重要なのは、Ib自身が最初から膜を貫通する針の形をしているわけではないことだ。まず膜表面で「プレポア」と呼ばれる前段階の集合体を作り、その後、大きな構造変化を起こして膜貫通型のポアになる。

プレポアと完成ポアの構造はこれまでにも研究されていた。しかし、途中の中間体は寿命が短く、試料中で混在し、構造解析の対象として安定化しにくい。「始点」と「終点」は見えても、その間の動きが抜け落ちていた。

偶然の「Ibロゼッタ」が時間を止めた

突破口は、研究の途中で偶然現れた。複数のIbオリゴマーが放射状に集まった大きな超複合体で、研究チームはその姿から「Ibロゼッタ」と名付けた。京都大学の杉田・野田両氏は、古くから知られるインフルエンザウイルスHAタンパク質の「HAロゼッタ」を思わせる形だったとコメントしている。^[3]

このロゼッタでは、通常なら短時間で通過してしまうポア形成途中のIbが安定化されていた。研究チームは単粒子クライオ電子顕微鏡解析によって粒子を分類し、Prepore I、II、III……VIIIまで、8種類の異なる中間構造を同定した。^[1]

構造データはProtein Data Bank（PDB）やElectron Microscopy Data Bank（EMDB）にも登録されており、たとえばPrepore Vは7量体としてPDB 9JSL、対応するEMマップはEMD-61776として公開されている。^[4]

7分子は「一斉変身」しない

7個のIb分子がリングを作るなら、対称性を保ったまま全サブユニットが同時に構造変化する――直感的にはそう考えたくなる。ところが観察結果は逆だった。

Prepore IからVIIIを比較すると、まず1個のIbが成熟型へ近づき、次にその隣、さらに隣へと構造変化が伝わる。1個、2個、3個と成熟したサブユニットが連続的に増え、最終的に7個すべてがポア型へ移る。研究チームはこれを「ドミノ倒し」のような段階的成熟機構と表現した。^[1]

この非対称な中間過程は、完成構造だけからは見えにくい。完成ポアは最終的に七回対称に見えるが、そこへ到達する道筋は一時的に非対称だったということになる。

Φクランプは「完成してよいか」を判定する場所か

イオタ毒素Ibのポア内部には、最も狭い部分としてΦ（ファイ）クランプがある。芳香族アミノ酸残基が輪状に並び、孔を通る酵素成分Iaの膜透過に重要な部位だ。過去の構造研究では、IaのN末端がIbポアへ入り、狭いΦクランプ方向へ伸びていく様子まで可視化されていた。^[5]

今回、研究チームはΦクランプ近傍のアミノ酸D452をアラニンへ置換したIb（D452A）を調べた。するとポアになる前の構造が安定して蓄積した。これはΦクランプ周辺の正しい組み替えが、プレポアから成熟ポアへ進む際の重要な構造的「チェックポイント」になっている可能性を示す。^[1]

ここでいうチェックポイントは細胞の意思決定ではない。タンパク質の立体構造がエネルギー的・幾何学的に次段階へ進める条件を満たしたか、という意味である。

なぜ中間体を捕まえるのが難しいのか

タンパク質構造解析では、安定した状態ほど観察しやすい。プレポアは比較的安定で、完成ポアも最終状態として存在できる。しかし「プレポアからポアへ変わっている途中」は本来一過性である。化学反応の遷移状態に近い考え方で、短時間しか存在しない構造ほど試料中の割合も少なくなる。

しかも膜孔形成タンパク質は、膜へ挿入するため疎水性の部分を露出させる。膜環境から外すと凝集しやすく、均一な試料を作ること自体が難しい。この事情は炭疽菌毒素、エアロリジン、コレステロール依存性細胞溶解毒素など、多くのβ型ポア形成タンパク質研究でも共通の難題だった。^[6]

クライオ電子顕微鏡が「動いている分子」を構造へ変えた

この分野を大きく変えたのがcryo-EMだ。試料を極低温で急速凍結し、水を結晶氷ではなくガラス状の「非晶質氷」として固めることで、分子を溶液に近い状態のまま保持する。多数の粒子像を撮影し、コンピューターで向きを揃え、分類・平均化して3次元構造を再構成する。

2017年のノーベル化学賞は、ジャック・デュボシェ、ヨアヒム・フランク、リチャード・ヘンダーソンの3氏に「溶液中の生体分子の高分解能構造決定のためのクライオ電子顕微鏡法の開発」に対して授与された。ノーベル財団はこの技術の価値の一つを、生体分子を「動きの途中」で凍結し、従来見えなかった過程を可視化できる点に置いている。^[7]

現代の単粒子解析では、同じ試料に混在する異なる立体状態を計算上で分類できる。今回のように「8種類の中間体」を見分ける研究は、その強みを直接利用したものだ。

1990年代から続く「ポアを見る」競争

膜孔形成毒素の構造生物学には長い歴史がある。1996年には黄色ブドウ球菌αヘモリジンの七量体ポアがX線結晶構造解析で明らかになり、βバレル型膜孔の代表像となった。炭疽菌毒素のProtective Antigen（PA）も七量体プレポアから膜孔へ移行し、Lethal FactorとEdema Factorを細胞質へ送り込むモデルとして研究されてきた。^[6]

しかしX線結晶構造解析は、膜へ挿入された巨大で柔軟な複合体や、複数の中間状態を扱うのが難しい場合がある。cryo-EMの「分解能革命」は、膜孔そのものだけでなく、変換途中を比較できるところまで研究を進めた。

同じ研究系が2020年に「通過する瞬間」を見ていた

京都産業大学の津下研究室はイオタ毒素を長年追ってきた。2020年には山田氏らが、大阪大学などとの共同研究でIb膜孔そのものと、酵素成分Iaが結合した複合体をcryo-EMで解析した。IaがIbへ結合すると、そのN末端のαヘリックスがほどけ、細いひも状になってポア内部の狭窄部位へ向かうことを明らかにした。^[5]

2022年にはディフィシル菌の二成分毒素CDTについても、酵素成分CDTaが膜孔CDTbへ結合し、N末端からほどけ始める構造を示した。^[8]

つまり一連の研究は、「毒素酵素ができあがった孔をどう通過するか」から、「その孔自体がどの順番でできるか」へと時間をさかのぼってきたことになる。

ウェルシュ菌とイオタ毒素を混同しない

ウェルシュ菌はヒトや動物で多様な疾患を引き起こすが、菌株ごとに持つ毒素は異なる。一般的なヒトのウェルシュ菌食中毒で中心的役割を持つのは主にエンテロトキシン（CPE）であり、イオタ毒素は古典的分類ではタイプE菌株に関連する。イオタ毒素のヒト疾患における寄与については、他の主要毒素ほど確立していない。^[9]

したがって今回の成果は「一般的な食中毒の仕組みを直接解明した」と表現するより、膜孔形成タンパク質という広い分子機構のモデルとして理解する方が正確だ。

ポア形成タンパク質は「毒」だけではない

膜に孔を作るタンパク質は細菌毒素だけに存在するわけではない。免疫系にも、標的細胞の膜へ孔を作って攻撃する分子機構がある。膜孔形成は、感染、防御、細胞死にまたがる生物学の基本原理の一つだ。^[6]

さらに工学分野では、ナノサイズの孔を使ってDNAやRNA、タンパク質などの分子を一個ずつ検出するナノポアセンシングが発展している。孔の直径、電荷、疎水性、ゲート機構を原子レベルで理解できれば、人工ナノポアや選択的分子輸送装置を設計する材料になる。

研究チームも、今回得た一連の「ポアができるまで」の構造スナップショットが、人工ナノポアや細胞内分子送達技術の構造基盤になる可能性を挙げている。^[1]

ただし応用はまだ遠い

ここからすぐに新薬やドラッグデリバリー装置が生まれるわけではない。今回の研究は構造機構の解明であり、細胞や動物でD452やΦクランプを狙った阻害が感染症治療につながることを示した試験ではない。

また、Ibロゼッタという特殊な超複合体が中間状態を安定化したことは研究上の幸運だった一方、それら8状態が生体膜上でまったく同じ寿命・割合で現れるかは別問題だ。cryo-EMで見える構造系列と、細胞内での時間的な速度論をつなぐ追加研究が必要になる。

それでも、これまでブラックボックスだった「リングが膜へ刺さる途中」に複数の実在する構造があること、しかも変化が七分子へ順番に伝わることを示した意義は大きい。

構造生物学が「写真」から「映画」へ近づく

構造生物学は長く、分子のもっとも安定な姿を一枚の静止画として捉える学問だった。しかし生命現象の本質は動きにある。タンパク質は結合し、開き、折れ、回転し、膜へ刺さる。

今回の8つのプレポアは完全な動画ではない。それでも、異なる瞬間に固定された構造を正しい順序へ並べれば、分子がどう変化するかという「ストーリーボード」が見えてくる。

七つのIb分子が輪を作り、そのうち一つがまず形を変え、次へ、さらに次へと変化が進む。最終的には対称な膜孔が完成する。細菌毒素の攻撃装置は、スイッチを一斉に入れるようにではなく、ドミノを倒すように組み上がっていた。